为什么我可以叫“抗衰老口服液”

青春宝抗衰老剂对衰老大鼠学习记忆和自由基代谢的影响

（浙江中医药大学动物实验研究中心/比较医学研究中心，杭州 310053）

[摘要]

目的

观察青春宝抗衰老剂对衰老大鼠学习记忆和脑自由基代谢的影响。方法 选健康Wistar大鼠84只，雌雄各半，随机分为7组：空白对照组、模型对照组、青春宝抗衰老剂高、中、低剂量组、六味地黄丸组和首乌延寿片组。采用皮下注射D-半乳糖100mg/kg，各给药组同时开始灌胃给药，连续造模49天，造成大鼠衰老模型。观察大鼠一般情况，记录体重，以水迷宫空间测试行为记忆能力，测定脑组织自由基代谢SOD、MDA、GSH-Px、Na+- K+- ATPase、Ca++-Mg++-ATPase、NO和TCHE的变化。

结果

与空白对照组比，模型对照组体重增长率下降（P<0.01），脑组织中SOD、Na+- K+- ATPase、Ca++-Mg++-ATPase和GSH-Px活力下降（P<0.05，P<0.01），MDA、NO和TCHE均明显升高（P<0.05，P<0.01），水迷宫实验中探索路径和搜台潜伏期显著增加（P<0.01），提示D-半乳糖衰老模型成功。与模型对照组比，青春宝抗衰老剂能提高大鼠体重增长率，提高脑组织中SOD、Na+- K+-ATPase、Ca++-Mg++-ATPase和GSH-Px活力（P<0.05），显著降低MDA、NO含量和TCHE活性（P<0.05，P<0.01），显著缩短衰老大鼠在水迷宫实验的探索路径和搜台潜伏期（P<0.01）。

结论

青春宝抗衰老剂可延缓自由基造成脑组织的脂质过氧化，具有抗衰老作用，并能改善衰老大鼠的学习记忆能力。

[关键词] 青春宝抗衰老剂，学习记忆，自由基代谢， 乙酰胆碱酯酶

Effect of Qingchunbao on Special Learning and Memory and Free Radical Metabolism of Brain of ageing rats

（Zhejiang Chinese Medical University Laboratory Animal Research Center， Hangzhou 310053， China）

[Abstract] Objective： To observe changes of Qingchunbao on special learning and memory and free radical metabolism of brain of ageing rats。 Methods： 84 healthy Wistar rats， half male and half female， were randomly divided into 7 groups： blank control group， model control group， low， middle， high dose Qingchunbao groups， Liuwei Dihuang Pills group and Shouwu Yanshou tablet group。 Ageing model was established by injecting D-galactose subcutaneously and ageing mice were given Qingchunbao， Liuwei Dihuang Pills and Shouwu Yanshou tablet respectively。 The general conditions， body weight and the spatial memory abilities were observed。 The SOD， GSH-Px， Na+- K+- ATPase， Ca++-Mg++-ATPase and TCHE activities， MDA and NO contents in rat brain tissue were detected finally。

Results： The body growth rate of model control group was lower than that of blank control group（p<0.05）.The activities of SOD， Na+- K+- ATPase， Ca++-Mg++-ATPase and GSH-Px in brain tissue were lower（P<0.05，P<0.01），and MDA，NO and TCHE in brain tissue of model control group were higher than those of blank control group（P<0.05，P<0.01）.The rats in model control group performed longer swimming lengths and longer latent periods during water maze test than those of blank control group（P<0.01）.Those all suggested a successful D-galactose induced ageing model。 Compared with model control group， Qingchunbao could increase body weight growth rate; raise the activities of SOD， Na+-K+-ATPase，Ca++-Mg++-ATPase and GSH-Px （P<0.05）， significantly suppress MDA，NO and TCHE in rat brain tissue（P<0.05，P<0.01）， and remarkably reduce the swimming lengths and latent periods during water maze test （P<0.01）。

Conclusion： Qingchunbao could relieve the damage of lipid peroxidation caused by free radicals in the brain tissue of rat ageing mode1， has an anti-ageing effect， and improves the learning and memory abilities of ageing rats。

[Key words]： Qingchunbao; learning and memory; free radical metabolism; acetylcholinesterase

【下文具体实验情况】

肾为先天之本，主骨生髓，脑为髓海。人至老年，是肾气先亏，《素问·上古天真论》云：“五八肾气衰，发坠齿槁”。肾气衰则脑海不足，精气衰少，因而身体渐衰，智力减退，精力不足，筋软骨弱，元气亏虚，血行不畅。故当治以益肾健脑，补气生津，活血化瘀。青春宝抗衰老剂是目前国内有较大知名度的抗衰老中成药，由红参、生地黄、天冬、麦冬等多昧药材组成，具有补泻兼备，寓补于泉，秉性中和，调理适度的特点，为了进一步探讨其作用机制，本实验观察了青春宝抗衰老剂对D-半乳糖所致衰老模型大鼠学习记忆和脑自由基代谢的变化。

1材料与方法

1.1 药物与试剂 青春宝抗衰老剂，批号：080320，由正大青春宝药业有限公司提供；六味地黄丸，批号：707360，北京同仁堂科技发展股份有限公司产品；首乌延寿片，批号：A060801，上海和黄药业有限公司产品；D-半乳糖购自上海恒信化学试剂有限公司（原上海试剂二厂），批号：20071115；考马斯亮兰蛋白，丙二醛 （MDA），超氧化物岐化酶 （SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px），一氧化氮（NO），ATP酶，乙酰胆碱酯酶（TChE）测试试剂盒购于南京建成生物工程研究所，批号均为20070718。

1.2 实验动物及饲养环境 SPF级Wistar大鼠，雌雄兼用，体重：雌200~220g，雄240~260g，由中科院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物公司提供[SCXK（沪）2007-0005]，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心屏障系统内[SYXK（浙）2003-0003]，温度24~26℃，相对湿度50%-70%。

1.3 主要仪器 BT- 815A半自动生化分析仪（上海三科仪器有限公司）；FJ-200组织匀浆机（上海标本模型厂）；Morris水迷宫（西班牙Panlab 公司）。

1.4 造模方法及给药

将大鼠购入适应性饲养1周后，观察有无异常情况，然后将大鼠称重，编号，按体重随机分组，分成7组，每组12只，雌雄各半，自由进食饮水。除空白对照组外， 其余各组每天颈背部皮下注射D-半乳糖生理盐水溶液，剂量100mg/kg，连续造模49天，每天一次。从造模第1天开始给药，青春宝抗衰老剂高、中、低剂量组分别灌胃给予0.60g/kg、0.30g/kg、0.15g/kg剂量的青春宝抗衰老剂浸膏粉，六味地黄丸组和首乌延寿片组分别灌胃给予六味地黄丸0.68g/kg和0.525g/kg，模型对照组和空白对照组每天灌胃给予蒸馏水10ml/kg，连续给药49天。

1.5 观察指标

1.5.1一般观察 每日观察大鼠皮毛、尾巴、粪便、活动情况，称取体重。

1.5.2 水迷宫空间行为记忆能力测试 采用Morris水迷宫测试。水迷宫主要由一漆成暗灰色的圆柱形水池和一金属站台组成。水池高50cm，直径80cm，站台直径10.0cm。水池上方通过一数字摄像机与计算机监视屏相连接。大鼠在水池中的全部活动情况可在监视屏中看到，利用计算机软件对其活动进行全程跟踪，并显示整个活动轨迹。当设定的训练时间已到或动物已爬上站台，计算机停止跟踪并记录下游泳轨迹和自动计算出动物在水池中所游过的路程，及找到站台所需的时间即潜伏期。用找到站台所需的时间表示大鼠的学习记忆能力。水池里的水面高出站台2cm，水温控制在22±0.5℃。实验在隔音安静的房间内进行，水池、日光灯、鼠笼等实验室各种物件的位置保持不变。实验采用一天训练2次，每次训练2分钟的方案。若动物2分钟尚未找到站台，将动物拿到站台上并使它在上面停留20秒。第3天进行水迷宫测试。

1.5.3 脑自由基代谢产物测定 取部分脑组织，用滤纸吸干水分后称重，迅速放入盛有碎冰块的小烧杯中冰浴，按体重体积比加预冷的生理盐水制备成10%的组织匀浆，3000rpm/min，离心15min，然后取组织匀浆上清再用生理盐水稀释成所需浓度，-70℃保存，待测。经考马斯亮兰测定组织蛋白，按试剂盒说明书分别测定脑组织SOD、MDA、GSH-Px、NO、TCHE、ATP酶活性，测定方法严格按照试剂盒说明书步骤进行。

1.6 统计学处理 所有计量数据均表示为均数±标准差（`x±s），采用SPSS11.0软件进行统计分析，检验方法采用One-way ANOVA分析和Dunnett-t检验。P<0.05表示差异统计学差异。

2 结 果

2.1 对衰老大鼠一般情况的影响

空白对照大鼠毛色白而光泽、耳色红润、活动自如、反应性好、饮食正常、尿液和粪便色形正常；模型对照大鼠从半乳糖皮下注射2周后即开始出现自主活动减少、行动迟缓、精神不振、嗜睡、反应不灵敏、饮食量减少、被毛卷曲、枯黄、易脱落、光泽欠佳等现象；造模4周后，尾部出现色素斑点沉着斑点，并随着时间的推移而加重；给予青春宝抗衰老剂、六味地黄丸和首乌延寿片后，异常的行为均有不同程度的缓解，如行动变得灵活，饮食增进，毛发较前润泽等。

2.2 对衰老大鼠体重的影响

与空白对照组比，模型对照大鼠体重增长明显缓慢（P<0.01），给予青春宝抗衰老剂、六味地黄丸和首乌延寿片后，均能不同程度的减缓抑制体重的下降，与模型对照组比，青春宝抗衰老剂高、中剂量组和首乌延寿片组大鼠体重增长变化率明显升高（P<0.05，P<0.01）。

表1 青春宝抗衰老剂对衰老大鼠体重增长变化的影响（`x±s，n=12）

注：与空白对照组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与六味地黄丸组比较，# P<0.05，## P<0.01；与首乌延寿片组比较，& P<0.05，&& P<0.01。

2.3 对衰老大鼠水迷宫学习记忆能力的影响

与空白对照组比，模型对照组衰老大鼠水迷宫探索路径长度、搜台潜伏期均显著延长（P<0.01）；给予高、中、低剂量青春宝抗衰老剂、六味地黄丸和首乌延寿片后，均能不同程度的显著缩短探索路径长度和搜台潜伏期（P<0.01），见表2。

表2 青春宝抗衰老剂对水迷宫学习记忆能力的影响（`x±s， n=12）

注：与空白对照组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与六味地黄丸组比较，# P<0.05，## P<0.01；与首乌延寿片组比较，& P<0.05，&& P<0.01。

2.4 对脑自由基代谢的影响

2.4.1 对脑组织SOD活性、MDA含量和GSH-Px活性的影响

脑是机体的重要器官，在生命活动中发挥着重要作用，人们发现自由基对脑的损伤是导致机体衰老的原因之一。从表3可见，与空白对照组比，模型对照大鼠脑组织SOD活性和GSH-Px活性均明显降低（P<0.01），MDA含量明显升高（P<0.05），提示大鼠的脑组织发生了脂质过氧化反应；给予高、中、低剂量的青春宝抗衰老剂浸膏粉、六味地黄丸和首乌延寿片后，均能不同程度的显著升高脑组织SOD和GSH-Px活性，降低脑组织MDA含量（P<0.05，P<0.01）。

表3 青春宝抗衰老剂对脑组织SOD活性、MDA含量和GSH-Px活性的影响（`x±s， n=12）

注：与空白对照组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与六味地黄丸组比较，# P<0.05，## P<0.01；与首乌延寿片组比较，& P<0.05，&& P<0.01。

2.4.2 对脑组织Na+- K+- ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性的影响

与空白对照组比，模型对照大鼠脑组织Na+-K+-ATPase和Ca++-Mg++-ATPase活性均显著降低（P<0.05，P<0.01）；给予高、中、低剂量的青春宝抗衰老剂、六味地黄丸和首乌延寿片后，均能不同程度的提高Na+-K+-ATPase和Ca++-Mg++-ATPase活性，但与模型对照组比较差异不显著（P>0.05），见表4。

表4 青春宝抗衰老剂对脑组织Na+-K+-ATPase和Ca++-Mg++-ATPase活性的影响（`x±s， n=12）

注：与空白对照组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与六味地黄丸组比较，# P<0.05，## P<0.01；与首乌延寿片组比较，& P<0.05，&& P<0.01。

2.4.3 对脑组织NO含量和乙酰胆碱酯酶（TCHE）活性的影响

与空白对照组比，模型对照大鼠脑组织乙酰胆碱酯酶（TCHE）活性和NO含量明显升高（P<0.01）；给予高、中、低剂量的青春宝抗衰老剂、六味地黄丸和首乌延寿片后，均能不同程度的显著抑制衰老大鼠脑组织乙酰胆碱酯酶（TCHE）的活性和NO含量（P<0.05，P<0.01），提示青春宝抗衰老剂能提高衰老大鼠的学习记忆能力，见表5。

表5 青春宝抗衰老剂对脑组织NO含量和TCHE活性的影响（`x±s， n=12）

注：与空白对照组比较，ΔP<0.05，ΔΔP<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与六味地黄丸组比较，# P<0.05，## P<0.01；与首乌延寿片组比较，& P<0.05，&& P<0.01。

3 讨 论

衰老的自由基理理论认为衰老是细胞成分积累性氧化损伤的结果，是由自由基反应引起的，自由基反应参与环境、疾病和遗传控制的衰老过程有关的衰老性改变。机体老化是体内细胞不断受活性氧如超氧阴离子O2-、羟自由基·OH、脂过氧自由基LOO-攻击的过程，诱发机体内不饱和脂肪酶的一系列脂质氧化连锁反应， 造成生物膜结构和功能损伤外 ，还可破坏核酸、蛋白质等生物分子，成为诱发组织器官老化的重要因素之一[1， 2] 。SOD是体内最重要的过氧化分子清除酶，和GSH-Px联合作用可有效防止组织细胞过氧化损伤[3] 。MDA是体内脂褐素形成的中间产物，它能间接反映机体内的脂质过氧化水平[4] 。通过皮下注射D-半乳糖，在体内代谢过程中产生过量的超氧阴离子自由基和H2O2引起代谢紊乱，升高体内自由基水平，过氧化体内组织，能制作和自然衰老类似的亚急性衰老模型[5] 。本实验结果显示，皮下注射D-半乳糖后，模型大鼠脑内SOD、GSH-Px和ATPase活性明显下降，MDA含量升高，提示大鼠抗氧化能力降低，脂质过氧化产物升高，符合衰老模型，且给予青春宝抗衰老剂后，能明显提高SOD、GSH-Px和ATPase活性，降低MDA含量，表明青春宝抗衰老剂具有抗脂质过氧化物的作用，进一步提示青春宝抗衰老剂具有一定的抗老化作用。

NO在中枢神经系统 （CNS）中一种重要的生物信使分子，在CNS中具有双重作用，既有神经保护作用，也有神经毒性作用，过量的NO则会作为强氧化剂与超氧阴离子发生反应，产生细胞毒性更强的过氧化硝基基团，对细胞产生毒性从而导致衰老的发生[6] 。中枢胆碱能通路是构成学习记忆的主要通路，乙酰胆碱 （Ach）是其中最重要的神经递质，它由胆碱乙酰化酶合成，胆碱酯酶分解，通过Ach受体发挥生物学效应。近年来研究表明，老化与AD病人脑组织胆碱乙酰化酶活性明显降低，胆碱酯酶活性明显升高，造成Ach含量不足，导致中枢神经系统功能障碍，出现活动数量减少，学习和认知能力下降甚至丧失[7] 。本实验结果显示，模型大鼠脑组织NO含量和乙酰胆碱酯酶（TCHE）活性明显升高，提示衰老大鼠的学习记忆能力出现明显的障碍，与水迷宫空间记忆能力实验中探索路径和搜台潜伏期明显延长相一致。给予青春宝抗衰老剂后，能明显降低脑组织NO含量和TCHE活性，缩短探索路径和搜台潜伏期，提示青春宝抗衰老剂具有改善学习记忆能力的作用。

综上所述，青春宝抗衰老剂可改善D-半乳糖所致衰老模型大鼠的学习记忆能力，具有增强记忆的功能，并能提高模型大鼠脑组织中SOD活性，提高GSH-Px活性，且升高Na+-K+-ATPase酶和Ca++-Mg++-ATPase酶的活性，降低脑内MDA、NO和TCHE含量，具有抗氧化作用。青春宝抗衰老剂抗衰老的作用机制可能与抑制体内脂质过氧化过程有关。

参考文献

[1] Harman D。 Free radical theory of ageing： effect of free radical reaction inhibitors on the mortality rate of male LAF mice[J]。 J Gerontol， 1968， 23（4）：476-482。

[2] Harman D。 Ageing：a theory based on free radical and radiation chemistry[J]。 J Gerontol， 1956， 11（1）：298-300。

[3] Kim F.J， Kim H.P， Hah Y.C， et al。 Differential expression of superoxide dismutases containing Ni and Fe/Zn in Streptomyces coelicolor[J]。 Eur J Biochem， 1996， 241（1）：178-185。

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[6] Bin Q.H。 Nitric oxide： a revolution of free radicals theory of ageing[J]。 Med Hypotheses， 1991， 34（1）：60-61。

[7] 陈旭军。张卫。 从中医邪正观看老年痴呆微观指标。 浙江中西医结合杂志， 2002， 12（3）：157-158

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