一。试验内容:
(一)抗肿瘤作用(增加协同抗肿瘤作用)
1。采用CCK-8法观察不同加工工艺灵芝孢子粉产品对L1210(小鼠急性淋巴白血病细胞)、RM-1(小鼠前列腺癌细胞)、LA798(小鼠肺腺癌细胞)等三个细胞株的体外增殖抑制作用,并计算出IC50;
2。测定不同加工工艺灵芝孢子粉产品LD50(预试验+正式实验):LD50与肿瘤细胞无关,是验证药物毒性大小的一个实验,又称急性毒性实验。预试验用于测定初步剂量范围,正式实验则是在预试验的基础上设定多个剂量,通过实验找到使半数动物死亡的药物剂量,为后面药效实验(整体实验)设定合适的药物剂量分组提供依据;(LD50暂时先不做,剂量按照每天人体口服剂量分为高、中、低剂量组,分别为高剂量组16g/天、中剂量组8g/天、低剂量组2g/天。)
3。根据上述试验的结果,来决定整体实验是做: L1210小鼠白血病的移植模型, 或是做RM-1小鼠前列腺癌, 或是做LA798小鼠肺腺癌的移植模型。
建立L1210,或是RM-1,或是LA798的移植模型,只做上述三种中的一种(调整浓度至1×107个/ml,每只DBA/2小鼠腹腔注射细胞悬液0.1ml),分组:分为正常对照组,荷瘤对照组,阳性药对照组,样品大剂量组,样品中剂量组,样品小剂量组共6组,灌胃给药15天,观察不同加工工艺灵芝孢子粉产品对荷瘤小鼠生命的延长率的影响,并绘制生存曲线。(给药方式改为注射和灌胃两种方式)
4。在建立上述移植模型基础上,同上分组,灌胃给药15天后,取小鼠脾脏,分离淋巴细胞,再以LPS或ConA刺激,培养48小时后,加入CCK-8,检测淋巴细胞增殖活力。
5。在建立上述移植模型基础上,同上分组,定期计数各组小鼠外周白细胞数量及观察细胞形态改变,取小鼠的肝、脾、肺、肾等脏器称重并制作病理切片。
(二)升高白细胞作用
1。建立白细胞低下小鼠模型
环磷酰胺为周期非特异性抗肿瘤药物,它能与发生烷化反应,抑制的复制与转录,也能导致基因错码,或引起链的断裂,损害功能与结构,甚至引起细胞死亡。环磷酰胺对造血系统的损伤主要以粒细胞减少为主,同时骨髓有核细胞的数量与增殖速度均下降,这些都与临床化疗患者的症状十分相似。因此,采用腹腔注射环磷酰胺方法复制的骨髓抑制模型,能很好的模拟临床恶性肿瘤患者化疗后出现的骨髓抑制状态。
C57小鼠,雄性, 20-22g,10只。连续腹腔注射环磷酰胺 50mg/kg,连续3天。第4天,取小鼠静脉血,检测白细胞数量及白细胞分类计数(中性杆状核粒细胞、中性分叶核粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)。
2。不同加工工艺灵芝孢子粉产品对小鼠的升白细胞作用。
C57小鼠,雄性,20-22g,将动物分组,每组10只:对照组、模型组、阳性对照组和给药组。各组动物腹腔给药14天,正常组和模型组给予自来水。给药第9天,除正常对照组外,各组均腹腔注射环磷酰胺50mg/kg,连续3天。末次给环磷酰胺后第3天,各组动物尾尖取血20μl,加入血液稀释液,检测白细胞数量及白细胞分类计数(中性杆状核粒细胞、中性分叶核粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)。
二。试验要求:
试验样品:
1)第一批实验:CCK-8试验样品和LD50(和预试验)样品各3.0g(以有效成分的重量计)。
2)第二批实验:需提供样品10.0g。
3)第三批实验:需提供样品10.0g。
三。试验经费:
1。离体实验,每个样品1.5万,5个样品共计7.5万;
2.LD50实验,每个样品1.0万,5个样品,共计5万;
3。抗肿瘤整体动物实验,每个样品3.5万,5个样品,共计17.5万;
4。升高白细胞动物实验,每个样品3.5万,5个样品,共计17.5万;
5。学校收管理费:10万
6。实验经费共计:60.8万 (60万元)
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