苯丙酮尿症是新生儿疾病筛查的重点病种之一，也是最早提出可治疗的遗传代谢性病之一。其确诊主要是根据血苯丙氨酸的测定，患儿血苯丙氨酸多在20mg/dl以上。如果早期诊断，早期治疗，可以使患儿免遭智力损伤。
苯丙酮尿症的检查方法：
1、酶学诊断 PAH仅存在于肝细胞中，其活性检测比较困难。DHPR、6-PTPS、GTPCH的活性可采用外周血细胞测定。
2、DNA分析 目前对PAH和DHPR缺陷可用DNA分析方法进行基因诊断。据国外报告，已能用完整的PAH基因cDNA为探针可在PAH基因内测得8种内切酶的10个RFLP位点，并用于产前诊断。但由于基因的多态性，新发现的基因缺失与突变型越来越多，分析结果务须谨慎。
3、BH4负荷试验（BH4 loading test） 明确为高苯丙氨酸血症后，需进行严格的BH4缺乏症筛查。一般在试验前2天暂停饮食治疗。试验当天口服BH4 20mg/kg，服前及服后2、4、6、8、24小时测定血苯丙氨酸浓度。血液中苯丙氨酸的浓度在口服BH4 （20mg/kg）4～8小时后降至正常，表示对BH4有反应；若苯丙氨酸完全无降低现象，即表示对BH4无反应；或24小时后血苯丙氨酸浓度下降30%以上为BH。反应性，下降10%～29%为部分反应性。
经过以上评估和检验，若血中苯丙氨酸升高，但酪氨酸正常或偏低，且尿中有苯丙酮类异常代谢产物时，可以推断为PKU的患者，并可进一步鉴别PKU的类型。如下：
典型PKU：B%正常或偏高.BH4的口服负荷试验无反应，DHPR活性正常。B%指生物蝶呤所占之比例，B%=[B/（B÷N）]×100%（B：生物蝶呤含量，N：新蝶呤含量）。
GTPCH缺乏型PKU： B%正常，但是N及B之含量很低，BH4的口服负荷试验有反应，DHPR活性正常。
6-PTPS或SR缺乏型PKU： B%<5%，BH4的口服负荷试验有反应，DHPR活性正常。
DHPR缺乏型PKU：B%>80%，BH4的口服负荷试验部分有反应，DHPR活性很低。
PCD缺乏型PKU：尿液HPLC分析可检出大量7-生物蝶呤（7-biopterin）。