寿仙谷灵芝孢子粉将开展对针对肿瘤的药效实验

一、试验内容：

（一）抗肿瘤作用（增加协同抗肿瘤作用）

1、采用CCK-8法观察不同加工工艺灵芝孢子粉产品对L1210（小鼠急性淋巴白血病细胞）、RM-1（小鼠前列腺癌细胞）、LA798（小鼠肺腺癌细胞）等三个细胞株的体外增殖抑制作用，并计算出IC50；

2、测定不同加工工艺灵芝孢子粉产品LD50（预试验+正式实验）：LD50与肿瘤细胞无关，是验证药物毒性大小的一个实验，又称急性毒性实验。预试验用于测定初步剂量范围，正式实验则是在预试验的基础上设定多个剂量，通过实验找到使半数动物死亡的药物剂量，为后面药效实验（整体实验）设定合适的药物剂量分组提供依据；（LD50暂时先不做，剂量按照每天人体口服剂量分为高、中、低剂量组，分别为高剂量组16g/天、中剂量组8g/天、低剂量组2g/天。）

3、根据上述试验的结果，来决定整体实验是做：L1210小鼠白血病的移植模型，或是做RM-1小鼠前列腺癌，或是做LA798小鼠肺腺癌的移植模型。

建立L1210，或是RM-1，或是LA798的移植模型，只做上述三种中的一种（调整浓度至1×107个/ml，每只DBA/2小鼠腹腔注射细胞悬液0.1ml），分组：分为正常对照组，荷瘤对照组，阳性药对照组，样品大剂量组，样品中剂量组，样品小剂量组共6组，灌胃给药15天，观察不同加工工艺灵芝孢子粉产品对荷瘤小鼠生命的延长率的影响，并绘制生存曲线。（给药方式改为注射和灌胃两种方式）

4、在建立上述移植模型基础上，同上分组，灌胃给药15天后，取小鼠脾脏，分离淋巴细胞，再以LPS或ConA刺激，培养48小时后，加入CCK-8，检测淋巴细胞增殖活力。

5、在建立上述移植模型基础上，同上分组，定期计数各组小鼠外周白细胞数量及观察细胞形态改变，取小鼠的肝、脾、肺、肾等脏器称重并制作病理切片。

（二）升高白细胞作用

1、建立白细胞低下小鼠模型

环磷酰胺为周期非特异性抗肿瘤药物，它能与发生烷化反应，抑制的复制与转录，也能导致基因错码，或引起链的断裂，损害功能与结构，甚至引起细胞死亡。环磷酰胺对造血系统的损伤主要以粒细胞减少为主，同时骨髓有核细胞的数量与增殖速度均下降，这些都与临床化疗患者的症状十分相似。因此，采用腹腔注射环磷酰胺方法复制的骨髓抑制模型，能很好的模拟临床恶性肿瘤患者化疗后出现的骨髓抑制状态。

C57小鼠，雄性，20-22g，10只。连续腹腔注射环磷酰胺50mg/kg，连续3天。第4天，取小鼠静脉血，检测白细胞数量及白细胞分类计数（中性杆状核粒细胞、中性分叶核粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞）。

2、不同加工工艺灵芝孢子粉产品对小鼠的升白细胞作用。

C57小鼠，雄性，20-22g，将动物分组，每组10只：对照组、模型组、阳性对照组和给药组。各组动物腹腔给药14天，正常组和模型组给予自来水。给药第9天，除正常对照组外，各组均腹腔注射环磷酰胺50mg/kg，连续3天。末次给环磷酰胺后第3天，各组动物尾尖取血20μl，加入血液稀释液，检测白细胞数量及白细胞分类计数（中性杆状核粒细胞、中性分叶核粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞）。

二、试验要求：

试验样品：

1）第一批实验：CCK-8试验样品和LD50

（和预试验）样品各3.0g（以有效成分的重量计）。

2）第二批实验：需提供样品10.0g。

3）第三批实验：需提供样品10.0g。

三、试验经费：

1、离体实验，每个样品1.5万，5个样品共计7.5万；

2、LD50实验，每个样品1.0万，5个样品，共计5万；

3、抗肿瘤整体动物实验，每个样品3.5万，5个样品，共计17.5万；

4、升高白细胞动物实验，每个样品3.5万，5个样品，共计17.5万；

5、学校收管理费：10万

6、实验经费共计：60.8万（60万元）