“这里是与病毒‘零距离’接触的地方，整个实验室完全密封，室内处于负压状态，我们喜欢用‘三流’来形容它，即人流、物流、气流的单向流动，确保在里面的污染物不会泄漏到外面而造成污染。” 广东省第二人民医院P3实验室主任林剑国说，而“这里”指的就是P3实验室。省二医每天400多份新冠肺炎核酸检测就是在这里开展的。
现在，让我们一起来揭开省二医P3实验室的神秘面纱，看看病毒究竟在P3实验室是怎样被“揪出来”的？
P3实验室主任林剑国博士
誉为“侦察兵”的检测团队
揭秘一：前世今生
P3实验室是生物安全防护三级实验室，P是Protection的缩写。整个实验室完全密封，室内处于负压状态，实验室内部的气体不会泄漏到外面而造成污染，也就是“气流”的单项流动。
根据微生物及其毒素的危害程度不同，生物安全防护实验室分为四级，一级最低，四级最高。一级实验室一般适用于对健康成年人无致病作用的微生物；二级适用于对人和环境有中等潜在危害的微生物；三级适用于主要通过呼吸途径使人传染上严重的甚至是致死疾病的致病微生物或其毒素；四级适用于对人体具有高度的危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明、尚无有效疫苗或治疗方法的致病微生物或其毒素。省二医新冠病毒核酸检测就是在P3实验室进行的。
揭秘二：抽丝剥茧
核酸检测是确诊新冠肺炎的“金标准”，而检测流程中的每一个环节都是精细活，容不得半点马虎。在操作中，实验员面对眼前的样本，需要“一个一个地揭开盖子，开盖加样和核酸提取”，这无疑是与“病毒”正面交锋。
实验室内的检测流程可分为5个步骤：样本进入“传递窗”——灭活处理——开盖加样和核心提取——扩增反应判断结果——高压灭菌。
1、样本进入实验室——“传递窗”隔离空气
图一 “传递窗”也叫做Air Lork（空气锁）
采集的检测样本如咽拭子或肛拭子，在进入P3实验室前得先进入一个特殊的窗口——“传递窗”，这个窗口也叫做Air Lork，空气锁。顾名思义，与空气有关，这个传递窗有不能同时打开的双重门，保证传递样本时带进去的空气被隔离在双重门中，保证实验室外的环境不受污染。这也是“三流”中“物流”，样本的命运起点，在这里开启它在实验室中短暂的一生。
2、检测前的灭活处理——相对安全
样本在水浴箱经半个小时56℃高温灭活，这样会使病毒蛋白不再有生理活性，失去感染、致病和繁殖能力，在对样本进行检测时相对安全，但是病毒蛋白的基因序列并没有受到影响。
3、检测的核心环节——进行开盖加样和核酸提取
标本处理间，在这里进行开盖加样和核酸提取
省二医检验医学部副主任技师胡亮杉是进入P3负压实验室完成设备调试、程序设定、试剂试用等前期准备工作的第一人。据她介绍，在标本处理间，实验员拿到灭活后的样本时，第一个动作就是振荡，尽量让拭子上的病毒洗脱在培养基溶液中，再静置五分钟进行沉淀。
接下来就是开盖加样，必须人手操作，而且需要两个人高度配合才能完成，一人拧开样本罐盖子，另一人拿着微量移液器在样本罐中吸取微量溶液，放到另一个提取管里，一个样本对应一个提取管，再拧上管盖。就这样，400多份样本要打开瓶盖吸取转移400多次，每一次都是实验员与病毒面对面的“开撕”。
“样本在开盖转移的过程中，病毒非常容易暴露在实验室的空气中，近在咫尺，与我们几乎就是零距离的接触了。”胡亮杉说，“开盖加样的时候，拿着微量移液器的手往往因为戴着双重手套，而显得有些笨拙，可又不得不小心翼翼，再加上眼罩、面屏和生物安全柜玻璃窗的三重阻隔，所有动作都显得缓慢，手也因为动作的缓慢劳累而不时颤抖，经常是左手扶着右手完成加样的。”
人工核酸提取的步骤更是复杂，考验的是需要实验员的耐心与谨慎。“核酸提取可以使用仪器辅助，但由于比对的需要，往往要加以人工操作，需要反复进行离心、加试剂、洗涤等10多个步骤，其中需要打开管盖的操作就达7次以上，完成一例人工核酸提取要50分钟左右。”胡亮杉说。
4、 扩增反应——45个循环绘制荧光曲线判断结果
通过核酸扩增仪进行扩增反应
根据曲线和参数分析判断结果
提取的核酸送到核酸检测室内，就要上仪器了。提取的核酸加入到扩增试剂中，通过荧光PCR仪进行RT-PCR反应，先将提取的核酸逆转录成DNA，再以DNA为模版，对特定位点进行扩增，利用不同的温度进行变性、退火和延伸，每个循环采集荧光值，45个循环后绘制荧光曲线，用时约110分钟，实验员根据荧光曲线分析判断结果的阴性和阳性。
5、污染物的高压灭菌处理
实验过程产生的污物通过高压灭菌后，按相关普通医疗垃圾处理。“物流”的终点在这里就结束了。
产生的污物高压灭菌后处理
揭秘三：倾柯卫足
“三流”中的“人流”又是什么？来看看工作人员是如何工作的。
首先在清洁区内穿戴中级防护服——通过缓冲间进入到实验室内负压工作间，在这里进行标本处理，核酸提取及检测——完毕后进行空间、表面消毒，按顺序脱下防护服——通过淋浴间更衣后，回到清洁区。这些步骤一个都不能少！
通过缓冲间进入到实验室内
核酸检测的主要宗旨是高效、有序和安全。为了确保安全，省二医采取了多种措施，第一，人员的筛选；第二，岗前进行安全培训；第三，进行严格的消毒灭菌制度；第四，感控督导员制度。到目前为止，P3实验室未出现过生物安全问题，当然也与平时训练有关。
穿着三级防护装备
揭秘四：弃伪存真
任何一个环节都不能忽视，任何一个环节出现问题都可能导致“假阴性”或“假阳性”。因此，为保障检测的质量，检测结果将经历重重的比对与复核。
据介绍，检测质量的保障措施在检测前就已经开始了，样本采集的医务人员必须经过严格的培训和考核才能上岗，样本的质量与采集的技术密切相关，每一帧动作流程都必须按规定进行，样本采集完后的护送工作都需按照严密的程序，由专人专道配送到实验室。
在检测过程中，实验员谨慎进行每一次测试，针对可疑样本，选用不同的试剂进行复核确定，以防止“假阴性”的出现；其次，每进行一批实验，均会随机插入三个以上空白对照，针对阳性样本会进行病毒基因的测序比对，以防止“假阳性”的出现。
检测后，定期随机抽取检测后的样本送第三方实验室进行检测，对数据进行对比分析，同时也参加卫生部和广东省临床中心的室间质评，保障检测的准确性。
揭秘五：所向披靡
P3检测团队目前有21人，实行一天三班制。实验室严格遵照“新型冠状病毒肺炎诊疗方案”及生物安全要求，检测人员需在P3实验室负压密闭的空间里穿着三级防护装备，5个小时不吃不喝，甚至穿戴成人纸尿裤以解决上厕所的需要。不仅如此，检测人员还要克服心理上的恐惧。咽拭子样本是从疑似患者鼻咽部采集，可能含有较多新冠病毒，检测人员从采样罐里拿出样本时，在这样密闭的环境中很容易借助空气传播，但他们依然无怨无悔地战斗在前线，把好第一道关。
“他们与战斗在病房里的医护人员不同，他们藏在实验室里，每天与病毒近距离接触，是别人看不见的‘最前线’。”省二医P3主任林剑国说。
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