灵芝三萜类药理作用研究

1、灵芝属三萜类新化合物

对灵芝脂溶性成分的研究在20世纪80年代达到了高潮，1982年Kubota等[2]首次分离到灵芝酸A（ganodericacidA）和灵芝酸B（ganodericacidB），1988年从灵芝属中分离得到103种三萜类新化合物[3]。

自1991年以来，从灵芝属真菌的子实体、孢子粉和菌丝体中先后又分离到19个三萜类新化合物[4～14]，用波谱技术对其化学结构进行了鉴定。

2、药理作用

2.1保肝作用王明宇等[15]从赤芝子实体中得到粗组分GT，进一步经硅胶柱色谱得5个组分（GT1～GT5），经HPLC检测证实该GT和GT2主要含灵芝酸A和赤芝酸A（lucidenicacidA）。实验表明GT和GT2对四氯化碳、氨基半乳糖苷和卡介苗+脂多糖所致的3种肝损伤模型小鼠有较好的保肝作用，可明显降低模型动物的血清ALT和肝脏TG含量，并不同程度减轻动物肝损伤。在小鼠免疫性肝损伤（BCG+LPS）原代肝细胞体外培养试验中，作者观察到GT（015，510，50，100μg·mL-1）和GT2（015，210，10，50μg·mL-1）可不同程度地降低损伤肝细胞上清液中ALT活性和NO的含量，与阳性对照药马洛替酯（malotilate）作用相似。

2.2抗肿瘤作用Toth等[16]首先报道了灵芝三萜类化合物的药理活性。作者从赤芝菌丝体中提取得到6个有细胞毒活性的三萜类化合物ganodericacidU，V，W，X，Y和Z，体外实验表明能明显抑制小鼠肝肉瘤（HTC）细胞的增殖。Lin等[17]从赤芝子实体中分离到2个三萜类化合物灵芝醛A和双氢灵芝醛A，体外实验表明两者有较强的抑瘤活性，对人肝肉瘤细胞和KB细胞ED50值均在1～11μg·mL-1，以灵芝醛A作用最强。

2.3抗HIV21及HIV21蛋白酶活性Min等[6]从赤芝孢子粉中分离得到ganodericacidβ，lucidumolB，ganodermanondiol，ganodermanontriol和ganolucidicacidA。体外试验表明对HIV21蛋白酶活性有明显抑制作用，其IC50分别为20，50，90，70和70μmol·L-1；此外，ganodericacidA，ganodericacidB和ganodericacidC1亦有中度的抑制作用，其IC50为140～430μmol·L-1。作者认为羊毛甾烷型母核C23或C224，C225位上的羟基是其抗HIV21蛋白酶活性的必需基团。Sahar等[5]用生物活性追踪法从赤芝子实体的甲醇提取物中分离得到13个化合物。在抗HIV21活性的初筛实验中，化合物ganoderiolF和ganodermanontriol可抑制由HIV21诱导的MT24细胞的细胞毒效应，两者IC100均为718μg·mL-1，而且此浓度仅为其细胞毒浓度的50%。抗HIV21蛋白酶实验采用受试物与重组HIV212PR及其合成底物体外共孵育，15min后三氟乙酸（TFA）终止反应，经HPLC方法检测水解产物和剩余底物，根据相对峰面积计算IC50值。结果发现ganodericacidB和ganoderiolB的抑制作用最强（IC50均为0117mmol·L-1）；ganoderiolF，ganodericacidC1，3β，5α2dihydroxy26β2methoxyergosta27，222diene，ganodericacidα，ganodericacidH和ganoderiolA有中度抑制作用，其IC50在0118～0132mmol·L-1。在对HIV21反转录酶的实验中，13个化合物在浓度低于0125mmol·L-1时，均无抑制活性。尽管实验对所试化合物的构效关系未能得到明确的结论，但作者认为有Δ7（8），Δ9（11）双键结构的羊毛甾烷型三萜化合物与抗HIV21活性密切相关，而甾醇类化合物（compound10～12）则无此活性。

2.4抑制血管紧张素转化酶（ACE）Morigiwa[19]报道用Friedland和Silverstein方法测定10个灵芝三萜类化合物在体外对ACE酶的作用，发现ganodericacidF对ACE有抑制作用，其IC50为417×10-6mol·L-1，其他9个化合物IC50在1×10-5～1×10-4mol·L-1范围内。

2.5抑制胆固醇合成Komoda等[20]报道，用大鼠肝细胞1×104×g离心得到的亚细胞上清液为体外反应体系，发现羊毛甾醇类衍生物72酮2羊毛甾282烯23β2醇、14α2甲基2胆甾272烯23β，15α2二醇和羊毛甾272烯23β，15α2二醇均可抑制由羊毛甾或24，252二羟基羊毛甾至胆固醇的生物合成。认为C27位羰基或C215位α2羟基是抑制胆固醇合成的必需基团。此外，作者经由methylganoderateC人工合成了化合物VI（252demethyl2lanost272oxo282en27β，15α2diol），证实其在体外能抑制胆固醇生物合成，药物终浓度为20和40μmol·L-1时，抑制率分别为72%和84%。Shiao等[21]在大鼠的高胆固醇饲料中加入灵芝的菌丝体，可显著降低血清和肝脏中胆固醇和甘油三酯的含量，并指出其有效成分是三萜类，主要是ganodermicacidR和S，可抑制食物中的胆固醇吸收。目前认为，灵芝中的氧化三萜类化学结构与哺乳动物胆固醇生物合成途径中羊毛甾醇后的中间体类似，可抑制胃肠道吸收食物中的胆固醇。这些氧化三萜类还抑制胆固醇合成过程中的限速酶32羟232甲戊二酸单酰辅酶A（HMG2CoA）还原酶，并因此而抑制胆固醇合成。体外实验，在考莱烯胺（cholesteramine）预处理的大鼠肝切片培养中加入灵芝所含的氧化三萜类，可使[223H]醋酸盐和[2214C]羟基戊酸参入胆固醇合成减少。可见这些氧化三萜类还影响胆固醇生物合成过程中羟基戊酸后的环节。

2.6镇痛作用Koyama等[22]报道，用醋酸扭体法为活性筛选指标，从灵芝子实体的二氯甲烷提取物部分经硅胶柱色谱和HPLC制备得到4个具有镇痛活性的灵芝三萜类化合物：ganodericacidsA，B，G和H。按剂量3～5mg·kg-1sc给药可产生较好的镇痛效果，扭体反应抑制率在30%～64%（P<0105），其中以ganodericacidH效果好。同时，作者对比分析了ganodericacidH和与其结构十分相似的compoundC6的镇痛作用，认为ganodericacidH作用强的原因是其C212位上的羟基被乙酰化，由此增加了该化合物的吸收度，而compoundC6的C212位上的取代基为羟基。

2.7对血小板聚集的影响Su等[23～24]报道ganodermicacidS（GAS，化学名：lanosta27，9（11），242triene23β，15α2diacetoxy2262oicacid）对TXA2在人源血小板中信号传导途径的影响。发现GAS对TXA2拟似物U46619所诱导的人源硅胶过滤处理的血小板（GFP）聚集具有明显抑制作用，可延迟血小板发生形态改变的时间，减少血小板的初始聚集并降低其聚集百分率，该抑制作用有剂量依赖性。2μmol·L-1GAS抑制率即可达到50%；当浓度增加至715和10μmol·L-1时，可完全抑制血小板聚集，但不能对抗TXA2所致血小板形态改变。细胞内[Ca2+]i测定显示GAS能明显抑制U46619诱导的血小板内[Ca2+]i增加；此外，可强烈抑制由U46619诱导的二乙酰甘油的形成。这表明GAS可能抑制了U46619对PLCβ1的诱导活化。TXB2生成测定实验显示GAS可显著抑制由U46619诱导的TXB2生成，提示GAS可能抑制PLA2的活化。作者还测定了血小板内cAMP水平，发现单用GAS不影响静息血小板细胞的cAMP水平，但是能剂量依赖性地升高PGE1诱导的血小板内cAMP水平；U46619能够抑制PGE1或PGE1+GAS诱导的血小板cAMP水平增高，其抑制率可达40%，表明GAS不能对抗U46619的这一抑制作用。作者采用蛋白免疫印迹法检测了血小板中蛋白2酪氨酸磷酸化的形成，结果显示GAS对早期的蛋白2酪氨酸磷酸化无抑制作用，但可明显抑制第2、第3期的磷酸化反应，对p53～58及p51的抑制率可达30%；与此同时，对其余蛋白质磷酸化反应的抑制率则超过70%。提示GAS可能抑制了与整合蛋白αIIbβ3启动及血小板聚集有密切相关的蛋白2酪氨酸磷酸化过程。根据这些实验研究结果，作者认为GAS是通过抑制血小板2TXA2反应系统中TXRα2Gq2PLCβ1信号传导通道的蛋白2酪氨酸磷酸化过程，使二乙酰甘油和[Ca2+]i水平降低，最终抑制血小板的脱颗粒和聚集；GAS并不影响血小板2TXA2反应系统中的另一信号传导通道TXRβ2Gi。推测这两个通道的脂质微环境有所不同，GAS可能更易于与前者的微脂质区结合，从而抑制该通道的信号传导。

2.8抑制真核细胞DNA多聚酶活性Mizushina等[29]从赤芝中分离得到2个新三萜类化合物lucidenicacidO和lucideniclactone，两者在体外对真核细胞DNA多聚酶的活性都有选择性抑制作用。LucidenicacidO和lucideniclactone不仅对小牛DNA多聚酶α和大鼠DNA多聚酶β，而且对HIV21反转录酶亦有抑制作用，但是对原核细胞DNA多聚酶和其他DNA代谢酶，如T7RNA多聚酶、DNA酶I的活性没有影响。

3、展望

有悠久药用历史的灵芝是中医药学宝库中的珍品，拥有广泛的生物活性。灵芝所含的三萜类化合物结构复杂，分子中功能基团较多，目前除了少数化合物进行了药理活性研究之外，多数未进行活性研究。有必要采用现代科学技术方法对其药理作用、构效关系、作用机理等方面进行深入和系统地研究，为开发利用灵芝资源打下坚实的基础。