灵芝中核苷类的含量测定(一)

我国灵芝（Ganodermalucidum（Leyss.exFL）Karst。）资源丰富，药用历史悠久，药用部位为子实体，具补中益气、滋补强壮、扶正固本、延年益寿等功效。现代药理实验证明，灵芝在抗病毒、抗肿瘤、增强机体免疫力等方面有显著的药理活性。灵芝中核苷类成分、尿嘧啶、腺嘌呤、腺苷、尿苷等为其活性成分之一””。目前，灵芝药用产品有注射剂、胶囊剂、片剂、冲剂及袋泡茶等。2000年广州市药品检验所黄红兵等，在对核苷类建立方法学基础上，首次报道用紫外分光光度法测定不同产地灵芝子实体中总核苷的含量，对不同产地的灵芝资源进行评价，并建立灵芝中尿嘧啶、腺嘌昤、腺苷及尿苷的薄层色谱鉴别方法。

（一）实验部分

1.1 实验材料

不同产地灵芝 （Ganoderma lucidum （leyss.ex Fr。）Karst。）均为市售所得，来源见表5—14。减压干燥，粉碎，过3号筛，备用。

1.2仪器与试药

美国惠普HP8452A紫外分光光度计，日本岛津UV-260紫外分光光度计，所用试剂均为分析纯；尿嘧呤、腺嘌啶。腺苷、尿昔均为瑞土FLUKA公司产品。

1.3 供试品溶液的制备

取样品粉末1.0g，精密称定，加50%乙醇溶液加热回流提取3次（40 ml，1h;20ml，0.5h;20ml，0.5h），过滤，合并滤液，蒸干，加适量5%乙醇使溶解，加硅胶1g拌匀，烘干，研细，装入一预先装填好的硅胶小柱（100-200目）1g，内径（10-15mm）。从顶部以苯：无水乙醇（体积比4：1）80ml，洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加50%乙醇溶解并定容至5ml，作为供试品溶液。

标准品溶液的制备：精密称取尿嘧啶、腺嘌吟、腺苷、尿苷对照品各10.0mg，分别置100 ml容量瓶中，加5%乙醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准品溶液。

1.4 总核苷的含量测定方法

1.4.1 吸收曲线的绘制 精密吸取供试品溶液及尿嘧啶标准品溶液各1.0ml;按照样品含量测定项操作，在分光光度计上扫描，得吸收光谱。供试品吸收曲线及最大吸收波长260nm，与尿嘧啶标准品完全一致，可以直接用分光光度计法测定供试品总核苷的含量。

1.4.2 标准曲线制备 分别吸取对照品溶液0ml，1.0ml，2.0ml，3.0ml，4.0ml，5.0ml，置50ml容量瓶中，分别加50%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，按照《中华人民共和国药典（1995年版）》的分光度试验，在260nm波长处测定吸收度。

以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。经回归统计，得标准曲线方程：A=0.0729C+0.0028，γ=0.9999。浓度在2.06-10.30μg·ml-1范围内，与吸收度呈线性关系。

1.4.3 样品的含量测定 精密吸取样品供试液1.0ml，置50ml容量瓶中。加50%乙醇稀释毛刻度，摇匀，在260nm波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液 相当下标准品溶液的浓度。计算，即得样品的总核苷含量。结果见表5-14。

1.4.4 回收率试验 取已知含量的样品5份，加入一定量的尿嘧啶，按照样品含量测定的方法测定。计算，回收率平均值为100.6%，RSD为1.3%。

1.5 薄层色谱鉴别方法

取供试品溶液4ml，蒸干，残留物加0.5ml，50%乙醇溶解，作为样品液，吸取样品溶液及标准对照品溶液各1μl，分别点于同一块含4%磷酸氢二钠的0.3%CMS制备的硅胶GF254薄层板上，经展开剂展开，取出，晾干后，置紫外光灯（254 nm）下检测。本实验比较了下列4种不同展开剂的展开效果（体积比）：正丁醇：乙腈：0.1mol·L-1醋酸铵：浓氨水=6：1：2；氯仿：醋酸乙酯：异丙醇：水：浓氨水=2：6：0.3：0.2；苯：醋酸乙酯：甲醇：异丙醇：水=6：3：1.5：0.3；苯：醋酸乙酯：甲醇：异丙醇：浓氨水=6：3：1.5：1.5：0.5。

（二）结果

2.1 赤芝中核苷类成分的薄层色谱比较

用薄层层析鉴别赤芝中的核苷类成分，样品经展开后，在与标准品相对应的位置上，均显相同荧光淬灭斑点（图5-29）。4种展开剂的薄层层析效果以氯仿：醋酸乙酯：异丙醇：水：浓氨水=8：2：6：0.3：0.2的展开效果最佳。用薄层色谱法鉴别灵芝子实体的核苷成分，具有简单易行、结果可靠、专属性强等优点。

2.2 不同产地灵芝子实体中总核昔含量的比较

从试验结果（表5—14）可以看出，台湾、江苏吴江和广东连县产的灵芝子实体总核苷含量较高≥0.4%，其含量都高于现在利用较多的广西0.33%）和越南（0.34%）产赤芝，而云南产灵芝总核苷含量普遍较低，均≤0.21%。因此，如果将总核苷作为灵芝主要活性成分之一，台湾、江苏吴江和广东连县产的灵芝资源质量较好，具有较高的利用价值和开发前景。