灵芝孢子油三萜类化合物的研究

沈建 刘诚 冯敏

南京南京中科集团股份有限公司中科研究院210008

摘要：建立灵芝孢子油所含三萜类组分的高效液相指纹图谱，利用Agilent高效液相色谱仪对10批次灵芝孢子油进行了分析。结果显示，10批次的灵芝孢子油样品均出现 10个主要特征峰，相对保留时间分别为0.41，0.33，0.32，0.30，0.29，0.26，0.26，0.28，0.32和0.60，并且10批次的灵芝孢子油样品的10 个主峰面积均在 80% 以上，重叠率均在 90% 以上。

关键词：灵芝 灵芝孢子 灵芝孢子油 三萜 高效液相色谱 指纹图谱

灵芝是灵芝属真菌，是扶正固本的珍贵药材，灵芝三萜类化合物是灵芝主要的化学成分，目前已分离出150余种，三萜类化合物具有较强的生理活性，如抑制肿瘤细胞增殖，抗补体、抗艾滋病、保肝、抗血小板凝集、抗组织胺释放、抑制血管紧张素转化酶活性、降低胆固醇作用等。

中药指纹图谱是指中药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到能够标示该中药特征的共有峰图谱，通过把握中药指纹的特征，有效地鉴别中药的质量，确保中药材及中成药质量相对稳定，现在已经成为控制中药质量的一种有效的方法。作者利用高效液相色谱，建立了灵芝孢子油三萜组分的高效液相指纹图谱。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent1100高效液相色谱仪，四元泵，二极管阵列检测器，真空脱气机，柱温箱，自动进样器，美国Agilent公司产品，处理软件：Agilent化学工作站。

色谱条件：色谱柱：美国luna C18柱（250mm×4.6mm），流动相：乙晴：磷酸（40：60），流速：0.8ml/min，检测波长：234nm。

1.2 材料

CO2超临界萃取灵芝孢子油（由南京中科药业有限公司提供），甲醇、醋酸为色谱纯。

2 方法

2.1 相对保留值指纹图谱的确定

选择一个保留时间居中且在各样品中均存在的色谱峰作为参照物，指定它的α=1，分别求出各样品中各组分的α（α=tR（i）/ tR（s），其中tR（i）为各组分的出峰时间，tR（s）为参照峰的出峰时间）。

以某一样品的色谱峰总面积为分母，各样品中每个色谱峰面积为分子，求得该色谱峰的峰面积比值（ratio of peak area， Ar），将它标在其α值项下，最后将各样品的α按由小到大的次序排列成行，得到10批次灵芝孢子油样品的相对保留值（α/Ar）指纹图谱（未提供试验数据），其中无相应的Ar时表示该样品不具有该α的色谱峰。

2.2 色谱峰的重叠率（overlap ratio， Ro）

选取参照样品为对照基准，以它的出峰数目和欲对比样品的出峰数之和为分母，两者具有相同α值的峰数之和为分子，以此分别求出样品的重叠率。

2.3 稳定性、仪器精密度和重现性试验

取同一灵芝孢子油样品，分别在0h，4h，8h，12h和24h检测指纹图谱，考察主要色谱峰的α和Ar的一致性。

取同一灵芝孢子油样品，经处理后，连续进样5次，考察主要色谱峰的α和Ar-的一致性。相对标准偏差（RSD）是试验可信度的一种考察标准，根据检测数据，计算各自的RSD。

同一孢子油样品5份，考察主要色谱峰的α和Ar的一致性，并计算各自的RSD。

3 结果

3.1 主要色谱峰面积Ap和样品重叠率

图1提供的是灵芝孢子油的HPLC谱图，记录谱图中可以看出，在分离40min后基本上无色谱峰出现，说明有效组分在1h内基本上已分离出来。

图1 灵芝孢子油的HPLC图谱

在所测定的10批次样品中，由于1号样品色谱峰总面积较大，峰数较多且具有代表性，故将其指定为标准，以保留时间为26.94min的峰作参照峰，计算各待测峰的α和Ar。和0.92。这10个主要色谱峰的相对峰面积均占总峰面积5%以上。表1中的结果显示，峰面积占总峰面积5%以上的10个主要色谱峰面积之和占总峰面积的百分比Ap-均在80%以上，并且10批次样品的重叠率较好，均在90%以上。

表1 10批次灵芝孢子油供试品HPLC主要色谱峰的面积比和重叠率

3.2 稳定性、仪器精度及重现性试验结果

如表2所示，同一孢子油样品，经过不同时间检测，考察的10个主要色谱峰的相对保留时间和峰面积比值的一致性较好，说明灵芝孢子油供试品性能比较稳定。

如表3所示，同一孢子油样品，连续进样5次（仪器精度试验），以及同一批号的孢子油样品5份（重现性试验），高效液相色谱指纹图谱中10个主要色谱峰的α和Ar的RDS均小于3%。

表2 稳定性试验的相对保留时间和峰面积比值

表3 仪器精度试验和重现性试验的实验结果

4 结论

建立灵芝孢子油高效液相指纹图谱，有利于确保灵芝孢子油中三萜类化合物的质量稳定和可控。该方法能全面反映灵芝孢子油中所含三萜的种类和数量，有效地体现出中药成分的复杂性，并且能用来鉴别灵芝孢子油的真伪和是否掺杂。同时，也可为灵芝三萜类新药的研发提供药学研究资料。

参考文献：1. Kiyotata K，Tooru I，Michiko A，et al .Antinociceptive component of Ganoderma lucidum.Plata Med，1997，63（3）：224-227。

2. Chen RY，Yu DQ.Progress in chemical studies on the triterpene constituents of Ganoderma.Acta Pharm Sin，1990，25（12）：940-953。

3. 灵芝三萜化学成分研究进展。药学学报.1990，25（12）：940-953。